Fluorescence vzniká přechodem mezi nejnižší vibrační hladinou S1 na jednu z vibračních hladin S0. Molekuly mají v základním a excitovaném stavu obecně různé dipólové momenty i polarizovatelnosti. Po absorpci se excitovaná molekula dostane do rovnovážného stavu až po vyrovnání sil, které na ni působí.Okamžitě po vyzáření světla se molekula nachází v nerovnovážném stavu, dochází k vibrační relaxaci na základní hladinu.

Fluorescenční rezonanční energetický transfer (FRET)
Jedná se o přenos energie mezi flouorofory. První fluorofor (donor) je excitován specifickou vlnovou délkou. Místo fluorescence je energie přenesena na druhý fluofor (akceptor). Ten pak vyzáří energii ve formě světla. K rezonančnímu přenosu energie dochází pouze za následujících podmínek:
1. Vzdálenost mezi molekulami je menší než 100 Å.
2. Emisní spektrum donoru se překrývá s absorpčním spektrem akceptoru.
3. Molekuly mají stejně orientované dipólové momenty.

Zpožděná fluorescence
Jedná se o fluorescenci s časem přechodu odpovídající fosforescenci a vlnovou délkou odpovídající klasické fluorescenci. Jde o termální excitaci molekuly z nejnižší hladiny triplexového stavu zpět na nejnižší hladinu excitovaného singletového stavu (je to reverzibilní přechod mezi T1 a S1.

K fluorescenci dochází po návratu na S1 (proto je vlnová délka stejná jako u běžné fluorescence). Přechod mezi systémy způsobuje zdržení celého děje (čas vyhasínání je mnohem delší než u běžné fluorescence).

GFP protein
V přírodě je fluorescence zastoupena ojediněle, nicméně s obrovským významem u zeleného fluorescenčního proteinu (GFP protein).

Ten byl objeven r. 1962 u medúzy Aequorea victoria. Nicméně nejdříve byl izolován protein odpovědný za bioluminiscenci - aequorin. Ten v přítomnosti kladně nabitých vápníkových iontů emitoval modré světlo. Modrá barva byla velkým překvapením, neboť studovaná medúza sama svítí jasně zeleně!

Následně byl izolován další protein, který silně zeleně fluoreskoval. Jeho absorpčnímu maximu odpovídalo 400 nm a emisní maximum 505 nm. Nabízelo se následující vysvětlení: aequorin svítí modře a nově objevený protein toto světlo účinně absorbuje a vysvítí jej jako zelené. Ve skutečnosti je situace ještě složitější – aequorin neemituje světlo, ale nezářivým přenosem (FRET) předá energii zelenému fluorescenčnímu proteinu, který ji pak vyzáří ve formě zeleného světla.

Význam GFP proteinu
Během 20. století se díky mnoha revolučním metodickým objevům v biologii a chemii podařilo odpovědět na podstatné otázky fungování organismů. Čeho se ale po dlouhou dobu nedostávalo, byl způsob, který by umožňoval v živých buňkách (a ještě lépe v celých mnohobuněčných organismech) studovat s dostatečným rozlišením dynamické procesy v konkrétních strukturách.

Většina znalostí o fungování a struktuře buněk byla získána až po jejich fixaci (pro účely mikroskopie) nebo homogenizaci (v biochemii). Až do objevu zeleného fluorescenčního proteinu nebylo možné si na buňku „posvítit“ zaživa a pozorovat jednotlivé buněčné struktury v jejich přirozeném uspořádání, aniž se do experimentálního systému zanášely další změny (artefakty).

Přelom přinesl právě objev GFP proteinu. Pokud vneseme genovou sekvenci kódující zelený fluorescenční protein do zvolené buňky a necháme protein syntetizovat, za přístupu kyslíku se stane fluoroforem a většinou v buněčné fyziologii nezpůsobí žádné změny. To nám umožňuje připojit zelený fluorescenční protein k téměř libovolným proteinům, v buňce je „rozsvítit“ a pozorovat jejich další osud mikroskopem po osvícení modrým světlem. Po genetické modifikaci GFP proteinu bylo možné rozšířit emisní spektrum i na jiné vlnové délky.

a b

Obr. 1: a) medúza Aequorea victoria (zdroj), b) Strukturu GFP proteinu tvoří tzv. beta-barel složený z 11 vláken beta – skládaných listů s jednou alfa-šroubovicí zanořenou do nitra „soudku“. Chromofor je součástí této šroubovice a je umístěn přibližně uprostřed molekuly (zdroj).

Obr. 2: Mnohobarevná fluorescence pomocí fluorescenčního mikroskopu, obrázek dělících se buněk – jsou zřetelná dvě jádra modře, zeleně cytoskelet, červeně mitochondrie (zdroj).

Obr. 3: Zeleně fluoreskující laboratorní myš a) normálně b) po ozáření modrým světlem (zdroj).

*************************************************************************************
Literatura:
Černý, Jan: Zelený fluorescenční protein, Vesmír 88, 228, 2009/4
Šesták, Zdeněk: Fytofluory, Vesmír 77, 302, 1998/6
Valeur, B.: Molecular fluorescence: principles and applications, Wiley-VCH, 2002

www stránky:
Stránky Jana Preislera    http://bart.chemi.muni.cz/

Aepuorea     http://faculty.washington.edu/cemills/Aequorea.html
(C. E. Mills, University of Washington)

GFP    http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/GFP-1.htm,
(Connecticut College, New London)

Fluorescence foundation
http://www.fluorescence-foundation.org/archives.aspx

Journal of Fluorescence
http://www.springerlink.com/content/1573-4994/